公元前331年，在埃及完成征服任务的亚历山大挥师北上，经叙利亚首府大马士革，越过两河流域，9月初直扑波斯腹地。此时的马其顿远征军，已是兵多将广、物资充足。
尽管兵力有所增强，但亚历山大丝毫不敢大意。他一路走来，未曾遇到阻击，他料定大流士此举意在诱敌深入，令马其顿军队拉长战线，耗其军力，损其物资。针对此，亚历山大沿途修建3座城池，并派兵把守，以做远征军后勤补给据点。其实，大流士之所以诱使亚历山大深入波斯腹地而不予抵抗，还因为他此时征兵众多，一旦远离富庶的巴比伦则恐军队缺粮，而且他已选好了有利于他庞大军队的战场。
自从伊苏斯战败后，大流士在短期内征集了一支号称百万的大军，其中步兵80万，骑兵20万，还有他此次最新改装的镰刀战车200辆。镰刀战车前面车辕装有利刃，两侧轮轴处装有长达一米的锋利镰刀，如此前突侧削，冲击力极强，正好对付马其顿方阵。此外，车内亦配有长矛、弓箭，供车上的一名士兵使用；另有一名驭手驾驭四匹罩有铁甲的战马。除了这一利器，大流士还为他的步兵换上防御性更强的盾牌、希腊式长矛，给骑兵特制了鳞片甲。整装已毕，大流士率领部队进入预定战场，命人铲平中间大片空地，以停放镰刀战车。此后就在他等待亚历山大前来的日子里，一直忙于操练军队。
就在亚历山大率军渡过底格里斯河时，公元前331年9月20日，突然发生了一次月食。这使马其顿军队大乱，士兵们以为自己的侵略行为触怒了天神，惶惶然之余纷纷指责亚历山大当初应该见好就收。亚历山大急中生智，令随军祭司阿利斯坦德走到士兵们中间，告诉他们月亮女神降怒只会吓坏波斯人，因为希腊人信奉的是太阳神，所以现在应该感到害怕的是那些波斯人。希腊人安静下来了，但是，那些波斯人的确被吓坏了。
高加米拉
在巴比伦往北大约300千米的底格里斯河上游东岸，有一大片紧依波斯帝国大道的砂土地，这里流传着一个美丽的传说。古代的一位波斯帝王，一次战败后被敌人紧追不舍，性命危急时，一匹骆驼拼命奔跑救了他。为了感谢骆驼的救命之恩，他便为它建了一座城，起名为“高加米拉”，意即“骆驼之家”。大流士特意选择了高加米拉，作为他与亚历山大一决高低的战场，因为他觉得伊苏斯会战的失败实因波斯军队所处战地不利，以致骑兵不得伸展。而高加米拉，不仅地势平利于骑兵施展，而且交通便利，不用担心粮道受阻。
在一向靠观测天象来预知国事的波斯帝国，这次月食被当做是亡国之兆。因为发生月食时天空中吹着西风，表明征服者来自西方；而当月亮重现天空时，又刮起了东风，这为大流士指明了逃亡的方向，也即只有逃往东方才能自保。大流士深谙此道，除了哀叹，他并不能像亚历山大那样拿出什么措施来安抚手下将士的心。联想到太后、王后、王子公主皆被亚历山大所虏，以及伊苏斯一战的失利，这位曾经显赫一时的波斯帝王不禁信心大挫。
公元前331年9月24日，亚历山大军帐中来了波斯使者，来人呈给他一封大流士的请和信。亚历山大当着众将的面宣读了信的内容：大流士出钱1000泰伦赎回王室成员；把他的一个女儿嫁给亚历山大为妻，并且将幼发拉底河以西的领土全部送给亚历山大。这样做的条件是，双方媾和，缔结联盟。这一请求立时得到了以帕门尼奥为首的不少马其顿将领的首肯。亚历山大立即回信，在信的结尾提出：除非大流士亲自来到马其顿军营投降，否则，他面对的只能是马其顿的刀兵。言下之意，大流士竟妄想与亚历山大平分秋色，后者希望得到的可是整个波斯帝国。
公元前331年9月30日，马其顿军队在高加米拉扎营。面对波斯大军无边无际的战阵，马其顿全军上下无不瞠目。当晚，听着波斯军队不时发出的巨大声浪，老将帕门尼奥建议亚历山大趁夜色袭击波斯阵营，以减少士兵们因对方人多势众而产生的畏惧感。这建议立刻得到众将领的响应。亚历山大则直截了当地说：“我不想靠窃取的手段赢得一场胜利。”但他并没有忽视充盈于马其顿军营的恐惧不安气氛，他在祭司阿利斯坦德的帮助下，趁士兵们睡觉之际，举行了一次秘密献祭，他祈求天神宙斯赐福于他，祈求恐惧之神不要光临马其顿军营。这之后，他回到自己的大帐，沉思对敌方案。良久，他沉沉睡去。
公元前331年10月1日一大早，帕门尼奥等将领来到亚历山大帐前听候命令。可是一贯早起的亚历山大仍在酣睡，这很让大家惊讶。当帕门尼奥不得不走进亚历山大的帐篷把他叫醒时，亚历山大微笑着说：“你们看，如今我们不必再于高山险滩间追赶一个东奔西跑的大流士，不必再担心他用诱敌深入、坚壁清野的战术来对付我们，我们马上就要跟他决战了，难道这不正表明我们已经赢得胜利了吗？”最高指挥官的这种自信，迅速感染了马其顿全体将士，他们披挂整齐，开始列阵，仅留下几千名色雷斯轻装步兵镇守大营，保护那些后勤物资。
两军阵前，亚历山大远望波斯阵容，立即猜出大流士如此布阵意在对己方形成两翼合围之势，夹击之下，以优势兵力将自己军队分而歼之。虑及此，亚历山大决定采取“中部突破”的战术。只要自己的防守军队能够托住敌人从两翼的进攻，吸引更多的敌军前来，那么，他就能带领一支骑兵突破大流士的中路。为了对付波斯军队的侧翼包抄，亚历山大在自己战阵最外围的侧后方分别安插骑兵。此外，为了破坏镰刀战车的杀伤力，亚历山大派几千名游击步兵散列于阵前。战阵后面1千米处，就是由1.5万名希腊联盟步兵组成的第二道防线，士兵们与主力战阵背对背，与最外围的骑兵联合共同抵抗波斯军队的纵深包抄。
为避开对方战车群对马其顿方阵构成的威胁，亚历山大命令大军以斜线逐步向右前方行进。大流士赶忙派左翼铁甲骑兵驰上去拦截。双方交战之初，马其顿右翼外围一度战事吃紧。由于阻止波斯骑兵向纵深包抄，马其顿外围骑兵阵线逐渐拉长，兵力不足之下，亚历山大派兵增援，于是，马其顿军队右翼和中路之间出现一个大缺口。大流士当然不会错过这个大好战机，当即下令两翼同时发动进攻。虽然波斯战车被有效破坏，但波斯右翼骑兵在马舍乌斯的指挥下，先是牵动贴撒利骑兵不断向外围移动，这样就带动了其右面两个马其顿方阵的外移。就这样，马其顿左翼阵线被打乱，又一个缺口出现。大流士见状，立即派其近卫军骑兵和印度骑兵直取马其顿阵线缺口。此时，一旦这支骑兵冲到马其顿军队后方，然后兜其尾部攻击，则波斯军胜券在握。可出乎意料的是，这支骑兵出现在马其顿军队尾部时，却径直突破亚历山大的第二道防线，向马其顿中军大营冲去。原来，他们此行目的是救回大流士的家人。这时候，这支近卫军与马舍乌斯的部分铁甲骑兵兵合一处，不费力地打败色雷斯步兵，开始洗劫马其顿大营。帕门尼奥急忙派人给亚历山大送信，请求增援。亚历山大告诉来人不必在乎那些物资，因为一旦取得胜利，所有的物资均归己有；而战败，则完全相反。
就这样，马其顿军队不仅两翼被围，中路被突破，就连中军大营都被敌人攻占。危急局势令马其顿士兵沮丧不已。正在这时，祭司阿利斯坦德突然骑马奔出，向士兵们高声指点有一只雄鹰正飞翔在亚历山大的头顶，向他指示胜利的方向。受此鼓舞，马其顿军队士气猛增，甚至第二道防线的希腊联盟步兵竟将波斯骑兵赶出大营。亚历山大一直在等待战机，当他看到波斯左翼骑兵竟然不攻击自己，而是全部向马其顿右翼外侧防线冲锋，他不禁大喜，便飞也似的率领近卫骑兵直扑波斯军队暴露在外的中路左侧。紧跟其后的近卫步兵和四个马其顿方阵也陆续赶来。这样一来，希腊雇佣军抵挡不住溃散开去。不多时，亚历山大已近在大流士眼前。那些波斯近卫步兵的尸体不断层叠倒在大流士车前，以致黄金战车不得动弹。这一次，大流士又选择了逃跑，这令波斯左翼阵线瞬间溃退。亚历山大紧追大流士，但随即收到帕门尼奥的紧急求救，他只得返回。可就在他赶到左翼战场时，发现那里的波斯军队已得到皇帝逃跑的消息撤退了。高加米拉会战以亚历山大胜利而告终。
几天以后，亚历山大乘胜进入巴比伦，在这座古城，他加冕为“亚洲之王”。接下来，他又进入大流士王宫所在地苏萨、波斯波利斯，劫掠了无法计数的金银财宝。在波斯波利斯，亚历山大还下令烧毁王宫。一切停当之后已是公元前330年夏天，亚历山大再次踏上追寻大流士的路途。但不久，他得到消息，大流士被巴克特里亚总督贝苏斯囚禁。后者打算弑君自立。亚历山大立刻命令军队追赶贝苏斯部队。眼看要追上时，贝苏斯忙让大流士骑马奔逃，但遭到拒绝，气急败坏的贝苏斯及其同伙竟用长矛猛刺大流士。当马其顿军队赶来时，大流士已经与世长辞，终年50岁。亚历山大深为大流士的死亡而难过，他命人将尸体运送回巴比伦，以君王规格予以安葬。
