（1）痰标本：视样本性，通常取2～4ml，盛于离心管中，加入1～2倍体积4%氢氧化钠（NaOH）消化液，拧紧离心管盖，摇振5～10分钟，使痰液充分匀化，室温放置。自加入氢氧化钠消化液起，整个处理时间应在15～20分钟。然后滴加5%～10%盐酸液中和，使混悬液变为淡黄绿色为止（pH值约6.8）。最后以1600~1800r/min 离心20-30分钟，取沉淀物用作镜检和分离培养及动物接种。样本数较多时，应分批处理。
（2）其他样本：尿液、胃或支气管灌洗液等可能污染样本可参照痰样本处理方法。血液、脑脊液、纯培养物等无污染样本，无需作去污染处理。
2.用于分离结核杆菌的动物接种试验流程
（1）接种剂量及部位：通常用豚鼠做试验，将经集菌处理的病料悬液注入豚鼠的腹股沟皮下，每只1～1.5ml，每份病料接种2～3只。如果病料中含结核杆菌，豚鼠在接种后2周对结核菌素产生变态反应阳性。因此，可在接种后3～4周，用1：20结核分枝菌素和牛分枝菌素以及禽分枝菌素各0.1ml分别皮内注射豚鼠。
（2）结果观察：若豚鼠感染牛分枝杆菌或结核分枝杆菌，那么他们对牛分枝杆菌素或结核分枝杆菌素将在注射部位出现明显的红肿反应，经72小时仍不消退，而对禽分枝杆菌素仅产生轻微反应，持续24～48小时就消失。若豚鼠感染禽分枝杆菌时，则对禽分枝杆菌素产生强烈反应，而对结核分枝杆菌素和牛分枝菌素仅有轻微反应或无反应。可借此区分病料中结核分枝杆菌的种类，但对人结核分枝杆菌或牛分枝杆菌还需进一步经致病力检测进行鉴别。试验豚鼠一般在接种病料后3周开始于注射局部发生溃疡，区部淋巴结肿胀。
（3）剖检：如接种后4～6周仍不死亡，可将其剖检观察病理变化。当感染结核分枝杆菌或牛分枝杆菌时，可见肝、脾和局部淋巴结形成结核结节病灶，肺在发病晚期也有病变，肾一般无病灶。如果感染的是禽分枝杆菌，则主要在注射局部产生脓肿和在邻近局部淋巴结形成结节病灶。从病灶组织可镜检到典型抗酸性菌和分离到结核杆菌。对结核菌素反应阴性的豚鼠应于接种后第6周剖检一只，8～12周再剖检一只。如被检材料来源于禽，即疑为有亲分枝杆菌时，可在接种豚鼠的同时，再接种鸡或家兔，10周内可使这两种动物死亡，在肝和脾上见有结核病灶。
3.用于致病力分种的动物试验
（1）动物接种：先将被检菌按其重量制成一定浓度的悬液，注射量以菌液中菌体重量计算。家兔耳静脉注射0.01mg菌体，鸡翅静脉注射1mg菌体，豚鼠皮下注射1mg菌体以作对照。
（2）结果观察：若被检菌株为牛分枝杆菌，家兔将在接种后5周死于急性结核病；禽分枝杆菌对兔的毒力低，一般在注射后10周死亡；而结核分枝杆菌用上述剂量不会使家兔死亡。家兔感染牛或禽分枝杆菌时，主要在肾、脾、肝和肺产生明显病灶。鸡感染禽分枝杆菌时，可在10周内死亡，但人工接种结核分枝杆菌或牛分枝杆菌不引起感染。豚鼠注射牛分枝杆菌时通常在6～8周内死亡，而结核分枝杆菌皮下注射10～13周内才使豚鼠死亡。根据三种动物的试验结果可鉴定被检菌属于何种菌。但一般认为，鉴别结核杆菌的种别最好根据分离物的培养特性（包括生化特性）和对动物的致病力试验综合加以判定。
6.污染物及动物尸体的处理：
痰瓶（盒）、废弃标本、培养物等污染物，均需经高压蒸汽灭菌后才能丢弃或清洗，严禁不经灭菌随意处理。将痰瓶（盒）等标本置于一搪瓷盘中，在生物安全柜内进行涂片操作。操作完毕后将盘与废弃物等置于含消毒液并套有耐高温高压塑料袋的容器中，一并进行高压蒸汽灭菌。
动物尸体需套入耐高温高压塑料袋的容器中，一并进行高压蒸汽灭菌。
7.应急措施
在注射过程中，用注射器和针头时有发生锐器意外刺伤的可能，同时存在被动物咬伤的可能。在此情况下，受伤人员应脱去保护服，洗净双手和受伤部位，用75%的乙醇消毒创伤处，及时送急救室，告知医生受伤的原因及所污染的微生物，征求并遵守医生的建议，并将受伤及治疗情况归档。如离心过程中发生收集管破裂应关闭电源并且保持离心机盖子关闭30分钟。如果在机器停止运行后发生了破裂，离心机盖应立即关闭并保持30分钟，并及时通知试验室生物安全员。
牛结核分枝杆菌的实验室消毒技术要求
一、已使用过的器械的处理：
在实验室标准条件下，把耐高温小型器械浸泡于10000mg/L二氧化氯和70%～75%乙醇均可在1分钟内杀灭实验标准株结核分枝杆菌；或将耐高温小型器械浸泡于有效氯浓度为2000mg/L的消毒液中30分钟，后装入耐高温生物安全专用塑料袋并扎紧封口后先经121℃高压蒸汽灭菌30分钟，再经134℃，18分钟高压灭菌，取出后用清水洗净晾干即可；对于不耐高温或不适合高压蒸汽灭菌的器械，可用3%～5%石炭酸溶液浸泡24小时或70%～75%酒精浸泡或擦拭数次。
二、事故发生后紧急处理措施：
1.结核杆菌的泄露
操作过程中发生泄漏，及时用布或纸巾覆盖并吸收溢出物，向布或纸巾上喷洒75%乙醇，并立即覆盖周围区域。在喷洒75%乙醇时，从溢出区域的外围开始，向中心进行处理，随后用紫外照射30分钟，将污物取走后，再次对污染区域用75%乙醇进行消毒，并采用干热消毒法处理。在消毒后，通知主管部门目前溢出或泄漏区域的清除污染工作已经完成。
2.结核杆菌沾染体表
若细菌溅到体表（应穿戴专用生物安全防护服），立刻用酒精棉球或0.5%碘伏对体表进行擦拭消毒，再用肥皂水清洗数次。
3.结核杆菌沾染防护服
若细菌溅到防护服上，应立刻将衣服换下并使衣服外面向内，经121℃高压蒸汽灭菌30分钟，再经134℃高压灭菌18分钟，随后按常规洗涤后备用。
4.手套划破
若操作过程中不慎划破一次性手套（通常佩戴三层手套），应及时弃去已破损手套并置于废料桶中，并立即更换新手套。
三、污染表面的处理：
用棉布或吸水纸蘸取70%～75%酒精擦拭操作台面和桌面并保持表面湿润数分钟，擦净之后紫外照射30分钟即可；地面撒上有效消毒药，如有效氯浓度达到3000mg/L以上的二氧化氯或70%～75%乙醇并保持湿润数分钟，清理干净后紫外照射30分钟即可。
四、实验中污染的液体废物的处理：
把液体废物收集于加有3%～5%石炭酸的耐高温生物安全专用塑料袋中并扎紧袋口后经121℃高压蒸汽灭菌30分钟，再经134℃，18分钟高压灭菌后统一处理。
五、实验中污染的废弃固体物的处理：
废弃的所有一次性器械、材料及暴露于高污染区的器械先用3%～5%石炭酸或有效氯浓度达到3000mg/L以上的二氧化氯浸泡30分钟以上，然后于121℃高压蒸汽灭菌30分钟，再经134℃，18分钟高压灭菌后统一处理。
六、废液缸的处理：
已用过的或污染的移液管、移液枪头等应置于装有3%～5%石炭酸或有效氯浓度达到3000mg/L以上的二氧化氯溶液的废物缸中，浸泡30分钟以上后经121℃高压蒸汽灭菌30分钟，再经134℃，18分钟高压灭菌后统一处理。
七、病理组织废弃物及感染尸体的处理：
感染牛结核的组织、脏器或尸体直接装入生物安全袋（此过程应避免血水或组织液泄漏），经121℃高压蒸汽灭菌30分钟，取出后弃置于指定地方。
八、实验室环境的消毒：
采用加热熏蒸法或化学发生法按照25ml/m3剂量甲醛熏蒸12小时以上，可有效杀灭空气中和光滑表面上污染的结核分枝杆菌。消毒后可用25%的氨水按照15ml/m3的剂量，加热蒸发30分钟，可驱除实验室内残余甲醛的刺激性气味。
