4.浸蜡
（1）石蜡Ⅰ（45～50℃）：60分钟。
（2）石蜡Ⅱ（56～58℃）：60分钟。
（3）石蜡Ⅲ（56～58℃）：60分钟。
注意事项：①熔化石蜡必须有专人负责，必须在熔蜡箱内或水浴中（70℃）进行，不得用明火加温。②熔蜡的容积应为组织块总体积的5～10倍以上。③组织块经二甲苯适度透明后方可转入浸蜡过程，应尽可能减少将透明后组织块表面的二甲苯带入熔蜡中。④浸蜡时间适宜，过短时浸蜡不充分（组织过软），过长时组织硬脆。⑤熔蜡应及时过滤、更换。
包埋
（1）先将熔化的石蜡倾入包埋模具中，再用加热的弯曲钝头镊子轻轻夹取已经浸过蜡的组织块，使组织块的最大面或被特别指定处的组织面向下埋入熔蜡中，应将组织块平整地置放于包埋模具底面的中央处。包埋于同一蜡块内的多块细小组织应彼此靠近并位于同一平面上；腔壁、皮肤和粘膜组织必须垂直包埋。
（2）将与组织块相关的病理号小条置入包埋模具内熔蜡的一侧。
（3）从包埋模具中取出凝固的包埋蜡块（简称蜡块），用刀片去除组织块周围的过多石蜡（以组织块周围保留1～2mm 石蜡为宜）。将包埋蜡块修整为规则的正方形或长方形。
（4）将病理号小条牢固地烙贴在蜡块一侧（编号应清晰可见）。
（5）包埋机的使用方法可参照有关厂商的说明书。
（6）注意事项
①应将组织块严格分件包埋。包埋时一定要认真核对组织块的病理号（包括次级号）、块数和取材医师对包埋面的要求，准确地置入相应的病理号小条。发生包埋差错时，必须立即与取材医师和病理科当班负责人取得联系，及时处置。
②必须严防各种异物污染，勿将无关组织如缝线、纸屑或其他异物（尤其是硬质异物）等埋入蜡块内。
③包埋过程要操作迅速，以免组织块尚未包埋妥前熔蜡凝固。
④包埋用的熔蜡应纯净，熔点适宜。浸蜡Ⅰ用软蜡（熔点为45～50℃），浸蜡Ⅱ、Ⅲ和包埋用蜡均用硬蜡（熔点为56～58℃）。
⑤包埋用熔蜡使用前应先静置沉淀、过滤。
⑥熔蜡时不得使用明火，以防燃烧。包埋用熔蜡的温度应低于65℃；包埋用的镊子不可加温过高，以免烫伤组织。
切片
（1）切片刀或一次性切片刀必须锋利。使用切片刀时，必须精心磨备（在低倍显微镜下确认刀刃无缺口）；使用一次性刀片时，应及时更换。
（2）载玻片必须洁净、光亮。
（3）将切片刀或刀片安装在持刀座上（以15°为宜）。
（4）将蜡块固定于支持器上，并调整蜡块和刀刃至适当位置（刀刃与蜡块表面呈5°夹角）。
（5）细心移动刀座或蜡块支持器，将蜡块与刀刃接触，旋紧刀座和蜡块支持器。
（6）修块（粗切）。用右手匀速旋转切片机轮，修切蜡块表面至包埋其中的组织块完整地全部切到。修块粗切片的厚度为15～20μm（注意：对于医嘱再次深切片，特别是在原切片中发现了有意义的病变而进行的深切片，应尽量少修块，以尽量好地获得有关病变的连续性）。
（7）调节切片厚度调节器（一般为4～6μm），进行切片。切出的蜡片应连续呈带状，完整无缺，厚度适宜（3～5μm）、均匀，无刀痕、颤痕、皱褶、开裂、缺损、松解等。
（8）以专用小镊子轻轻夹取完整、无刀痕、厚薄均匀的蜡片，放入漂浮器的温水中（45℃左右），使切片全面展开［注意：必须水温适宜、洁净（尤其是水面）；每切完一个蜡块后，必须认真清理水面，不得遗留其他病例的组织碎片，以免污染］。
（9）将蜡片附贴于涂有蛋白甘油或经3氨丙基三乙氧基硅烷（APES）处理过的载玻片上（HE 染色时酌情使用，可省略）。蜡片应置放在载玻片右（或左）2／3处的中央，留出载玻片左（或右）1／3的位置用于贴附标签。蜡片与载玻片之间无气泡。
（10）必须立即在置放了蜡片的载玻片一端（待贴标签的一端），用优质记号笔或刻号笔准确、清楚地标记其相应的病理号（包括次级号）［注意：必须确保载玻片上的病理号与相关组织石蜡包埋块的病理号完全一致，不得错写或漏写病理号］。
（11）将置放了蜡片的载玻片呈45°斜置片刻；待载玻片上的水分流下后，将其置于烤箱中烘烤（60～62℃，30～60分钟），然后即可进行染色。
（12）注意事项
①组织块固定、脱水、透明和浸蜡的质量直接影响切片的制备。切片过程中遇到的困难首先应注意从切片前的上述各环节中寻找原因。
②切片机的质量是制备优质切片的重要前提。要使用质量好的切片机，规范地切片，精心维护切片机。
③经由内镜、穿刺等获取的细小组织，应间断性连续切片多面（一般至少制备6张蜡片，必要时制备更多张）。须做特殊染色、免疫组化染色等的病例，可预制蜡片备用。
（二）常规切片自动组织处理机的操作
步骤的次序和各步骤的持续时间，总计需要14小时。
1.乙醇－甲醛（AF）固定液2×60分钟
2.95％乙醇Ⅰ2×60分钟
3.95％乙醇Ⅱ2×60分钟
4.无水乙醇Ⅰ60分钟
5.无水乙醇Ⅱ60分钟
6.二甲苯Ⅰ30分钟
7.二甲苯Ⅱ30分钟
8.石蜡Ⅰ30分钟
9.石蜡Ⅱ60分钟
10.石蜡Ⅲ90分钟
包埋参见上文
切片参见上文
注意事项
（1）必须按有关说明书的规定使用和维护自动组织处理机。
（2）要严防因停电、机械故障等造成组织块损坏。一旦发生此类事故，必须及时向病理科主任报告，尽快采取应急措施妥善处置。
（3）使用自动组织处理机时，应合理设定运行时间（充分利用夜间）。固定、脱水的环境温度不得大于30℃。乙醇、二甲苯和熔蜡的容积，要大于组织块总体积的5～10倍以上，并应经常过滤，保持清洁；应经常检查试剂的浓度，及时更新。对于多量组织块，可按其大小分批进行处理；小块组织可适当缩短处理时间。
三、脱钙骨和其他钙化组织，通常需要脱去钙盐后进行切片。骨组织脱钙前须先行固定。
（一）常规脱钙法
将骨组织锯成薄片（约1cm×1cm×0.3cm）。
在AF 中或4％中性甲醛中固定6～12小时。
将骨片置于5％硝酸（急需时可置于37℃温箱）中脱钙，至用针轻刺可进入时为止，需12～24小时（小块骨组织脱钙仅需2～3小时），其间可更新脱钙液2～3次。
流水冲洗1～2小时。
移入5％甲明矾液，2～4小时。
流水冲洗2～3小时。
常规脱水。
石蜡包埋。
（二）电解脱钙法
将骨片置于装有8％硝酸和10％甲酸混合液的电泳槽（有盖的方形玻璃标本缸或烧杯）内的阳极处，6V 直流电源下持续电解30分钟到3个小时，至用针轻刺可进入时为止。
（三）骨髓组织脱钙
可浸泡于苦味酸乙醇饱和液（占85％）、甲醛（占10％）和冰醋酸（占5％）的混合液中（同时进行固定和脱钙）。
（四）注意事项
1.骨片等脱钙组织的厚度适宜。
2脱钙组织与脱钙液的体积比＞1∶30。
3脱钙过程中应不时摇动，多次更换脱钙液。
4脱钙时间不可过长。
5微波处理可加速脱钙过程。
6脱钙后的组织必须用流水充分冲洗。
7用于包埋的石蜡硬度适中（不宜过软或过硬）。
四、苏木素－伊红（HE）染色HE 染色是应用最广泛的组织病理学常规染色技术。
（一）染色程序
石蜡H－E 染色（常规HE 染色）
1.二甲苯Ⅰ：5～10分钟。
2.二甲苯Ⅱ：5～10分钟。
3.无水乙醇Ⅰ：1～3分钟。
4.水乙醇Ⅱ：1～3分钟。
5.95％乙醇Ⅰ：1～3分钟。
6.95％乙醇Ⅱ：1～3分钟。
7.80％乙醇：1分钟。
8.蒸馏水：1分钟。
9.苏木精液染色：5～10分钟。
10.流水洗去苏木精液：1分钟。
11.1％盐酸－乙醇：1～3秒。
12.稍水洗：1～2秒。
13.返蓝（用温水或1％氨水等）：5～10秒。
14.流水冲洗：1～2分钟。
15.蒸馏水洗：1～2分钟。
16.0.5％伊红液染色：1～3分钟。
17.蒸馏水稍洗：1～2秒。
18.80％乙醇：1～2秒。
19.95％乙醇Ⅰ：2～3分钟。
20.95％乙醇Ⅱ：2～3分钟。
21.无水乙醇Ⅰ：3～5分钟。
22.无水乙醇Ⅱ：3～5分钟。
23.石炭酸－二甲苯：3～5分钟。
24.二甲苯Ⅰ：3～5分钟。
25.二甲苯Ⅱ：3～5分钟。
26.二甲苯Ⅲ：3～5分钟。
27.中性树胶封固。
上述第12、13项可省去，但第14项的冲水时间须延长至10～15分钟（细胞核显示更清晰）；第23项可用无水乙醇代替，北方地区可省略。
（二）染色结果
细胞核呈蓝色，细胞质、肌纤维、胶原纤维和红细胞呈不同程度的红色。钙盐和细菌可呈蓝色或紫蓝色。
（三）染色注意事项
切片染色前，应彻底脱蜡。
用含有升汞液体固定的组织，其切片染色前应先脱去汞盐。
（1）石蜡切片脱蜡至水洗。
（2）Lugol碘液：20分钟。
（3）流水冲洗：5分钟。
（4）95％乙醇：10分钟。
（5）水洗：1分钟。
（6）5％次亚硫酸钠水溶液：5分钟。
（7）流水冲洗：5分钟。
（8）显微镜观察除汞满意后，转入HE 染色。
脱除甲醛色素（必要时）。
（1）石蜡切片脱蜡至水洗。
（2）1％NaOH（1ml）与80％乙醇（99ml）混合液：10分钟。
（3）流水冲洗：5分钟。
（4）转入HE 染色。
严格执行HE 染色流程，用显微镜控制细胞核的苏木精染色质量。HE 染片应着色鲜艳，红、蓝分明，对比清晰。
载玻片自二甲苯取出后，应立即用洁净、光亮的盖玻片和稠度适宜的中性树胶湿封载玻片。封盖处内无气泡，外无溢胶。封片时必须进行操作人员和局部环境的二甲苯污染防护。不应将组织切片烤干或风干后再行封片。
必须在载玻片的一端牢贴标签。标签上应印有病理科所在医院的名称。标签上应清楚显示有关的病理号及其次级号；标签上的病理号应准确无误，无涂改。
制片完成后，技术人员应将切片与其相应的病理学检查记录单或取材工作记录单认真进行核对；确认无误后，将制备好的切片连同相关的活检申请单、活检记录单以及取材工作单等一并移交给有关的病理医师；交接双方经核对无误后，办理移交签字手续。
石蜡切片HE 染色的优良率（甲、乙级切片所占的比率）应≥90％。
制片工作一般应在取材后2个工作日内完成（不含进行脱钙、脱脂等需要特殊处理的标本）。
制片过程出现意外情况时，技术人员应及时向病理医师和病理科主任报告，并设法予以补救。
（四）HE 染色试剂的配制
苏木精染液
（1）Harri苏木精染液
苏木精1g无水乙醇10ml
硫酸铝钾20g蒸馏水200ml
氧化汞0.5g冰醋酸8ml
先用无水乙醇溶解苏木精，用蒸馏水加热溶解硫酸铝钾，然后将两液合并煮沸，加入氧化汞，继续加热和搅拌溶液至深紫色，随即用冰水冷却，恢复至室温后过滤备用。使用前加入冰醋酸并混匀、过滤。
（2）Gill改良苏木精液
苏木精2g无水乙醇250ml
硫酸铝钾17g蒸馏水750ml
碘酸钠0.2g冰醋酸20ml
先用无水乙醇溶解苏木精，用蒸馏水溶解硫酸铝钾，然后将该两液混合，再依次加入碘酸钠和冰醋酸。使用前过滤。
（3）Mayer改良苏木精液
A 液：苏木精2g无水乙醇40ml
B 液：硫酸铝钾100g蒸馏水600ml
将苏木精溶于无水乙醇中（A 液）；稍加热，使硫酸铝钾溶于蒸馏水中（B 液）。将A 液与B 液混合后煮沸2分钟，再用蒸馏水补足至600ml，加入400mg碘酸钠充分混匀。染液呈紫红色。
盐酸－乙醇分化液
浓盐酸1ml70％乙醇99ml
伊红液
（1）0.25％～0.5％伊红Y 水溶液：伊红Y0.25～0.5g蒸馏水100ml冰醋酸1滴（2）0.5％伊红Y－氯化钙水溶液：
伊红Y0.5g
蒸馏水100ml
无水氯化钙0.5g
（3）0.25％～0.5％伊红Y－乙醇溶液：
伊红Y0.25～0.5g80％乙醇100ml 4石炭酸－二甲苯混合液石炭酸1份二甲苯3份申请单及标本的验收、编号和登记一、申请单和标本的验收1病理科（或细胞病理室，下同）应有专人验收细胞病理学检查（细胞学检查）申请单和送检的标本。
（1）同时接受同一患者的申请单和标本。
（2）认真核对每例申请单与送检标本及其标志（联号条或其他写明患者姓名、送检单位和送检日期等的标记）是否一致；发现疑问时，应立即向送检方提出并在申请单上注明情况。
（3）认真检查标本的标志是否牢附于放置标本的容器上。
（4）认真查阅申请单的各项目是否填写清楚，包括：患者的基本情况［姓名、性别、年龄、送检单位（医院、科室）、床位、门诊号／住院号、送检日期、取材部位、标本数量等］；患者的临床情况［病史（症状和体征）、检验／影像学检查结果、手术（包括内镜检查）所见、既往病理学检查情况（包括原病理号和诊断）和临床诊断等］。
（5）在申请单上详细记录患者或患方有关人员的明确地址、邮编及电话号码，以便必要时进行联络，并有助于随访患者。
验收标本人员不得对申请单中由临床医师填写的各项内容进行改动。
