为了使自己的医术得到继承和传播，更为了抽出更多的时间悉心写书，李时珍在新州本地收留了一位徒弟。此人姓庞，名宪，号鹿门，性格乖僻，少言寡语，但对医术肯于钻研。他在恩师李时珍的指导下精读了《灵柩》和《素问》等书，学会了李时珍诊治疾病的许多技艺，成为继李时珍之后斯州最有名的医生。就连《本草纲目》中也凝聚了他的一份心血。
李时珍深知要写出价值超前的传世之作，光立足于蕲州这块弹丸之地是绝对不行的。48岁的李时珍带着徒弟庞宪、儿子李建元一起各自背着药箱，从嘉靖四十四年1565年）开始，告别蕲州，先后到江苏、安徽、江西、湖南、河南、河北和广东等省。李时珍不论走到哪里。他访医问药，留心观察。
李时珍带着弟子庞宪等人应邀给一位渔民治病。事后渔民家留他们吃饭，席间上了一盘河豚肉，肉质细嫩，味道美极了。李时珍见景生情，马上想到“舍命吃河豚”的谚语，领略了这句话的真切含义。闲聊时主人告诉他，吃豚油会使人舌头发麻，吃河豚籽会使人肚子发胀，吃河豚眼晴会使人眼睛发花，错误吃法还可使人送命。李时珍当即编了句顺口溜“油麻、籽胀、眼睛花”，告诫人们吃河豚时千万要谨慎，以防中毒。
李时珍的考察是全面而深刻的。他要留给后人的着作不仅仅是简单的成方，而是要详细叙述各种药材的生活习性、生长状况、人药方法、药用价值等，所以他的考察详细而入微。
李时珍知道穿山甲又叫“鲮鲤”，是一种珍贵的药材，可治多种妇科病，可他从未见过活的穿山甲，自然也就不知道它是如何捕食蚂蚁的。他在山民的协助下亲眼看到了穿山甲：形似鲤鱼，头如鼠，尖嘴，无牙，长舌头，鳞片较大，厚而坚硬，黑色，长有三角形的大尾巴，腹部有毛而无鳞甲。其捕食方法是靠嗅觉寻找蚂蚁洞，然后拱开蚁穴，将长舌头伸进去舔食蚂蚁。李时珍这些亲身经历，都记录到《本草纲目》之中。
李时珍外出考察了很多次，每次回乡总有一些病人慕名前来求医。其中绝大多数患者是药进病除，但也有特例。相传有位病人的病状十分特殊，李时珍不敢确诊，遂试探性地根据病情开了几味安全的药，非常诚恳地告诉病人再找别的大夫看一看。后来那位病人果然是靠吃了章大夫的药才治好病的。李时珍获悉后非但没有嫉妒贬低章大夫，反而化名为李壁，自称是江西瑞昌人氏，主动登门拜章大夫为师，潜心学习了半年之久才满载而归。
为把自己的着作写得科学、准确、全面、具体，力求至善完美。他走到哪里学到哪里，每到一处都要亲眼见识一下各地的特产药材，想方设法到制药作坊参观，学习制药的技艺。他收集了大量的极有价值的民谚匝口溜和民间偏方。
李时珍有较高的鉴赏力，文才很好且擅长诗文，因而，他对各地的民谣民谚有一种特殊的兴趣，其中那些具有医药学价值的都被他写进了书里。如：“人老伯大寒”、“三分吃药，七分调理”、“冬忌生鱼，夏忌狗肉”、“大豆加甘草，解毒效果好”、“刀豆烧成渣，服后呢逆下”、“穿山甲，王不留，妇人吃了乳长流”、“若食半边莲，可伴毒蛇眠”、“胭脂草捣烂，可治虫咬伤”、“七叶一枝花，深山是我家。
李时珍不论何时何地，也不管身体多么疲乏，他总是随时将自己的走访考察收获加以整理。嘉靖四十三年（1564年），长子李建中考中了举人，李时珍非常兴奋，情绪更加高涨，为完成自己的事业继续旅行，到庐山、茅山和牛首山等许多名山。就在他考察回归途中，听说嘉靖皇帝因服食金丹而毙命。新继位的明穆宗朱载豆下令大捕炼丹的方士，为父报仇。处决了一批方士，另有很多人受到连累。李时珍根本没有想到他已过世的父亲李言闻竟也受到了牵连，原因是父亲生前曾受道正柳道春之邀参加玄妙观的设计之务，现在却成了罪状。这是李时珍回到新州以后才知道，但他并没有因此而动摇自己的信念，更没有放弃自己，《本草纲目》的着述的追求。
李时珍从嘉靖三十一年（1552年）动笔到万历六年（1578年）定稿，前后经历了27个年头，再将考虑选题的时间也共计有30余年，着述《木草纲目》一书，正如李时珍本人所说：“岁历三十稔，书考八百余家，稿凡三易。”其子李建元在《进本草纲目疏》中亦讲：父亲“行年三十，力肆校雠，历岁七旬，功始成就”。在这30年当中，李时珍忘我劳作，全身心地投入到《本草纲目》的着述上来，熬过了千百个不眠之夜，前后三易其稿，终于实现了他重修“本草学”的夙愿。
李时珍自从他打定主意重修“本草学”着作那天起，阅读了八百多部相关的书籍，抄录近百万字的资料，又行程万里，走访过数以千计的各界人士，考察核对过千百种药物，收集了大量的实物标本，着述《本草纲目》耗费了他大半生的精力。在即将成书的那些日子里，把弟子和儿女全部动员起来，帮助抄写书稿。整理资料，分类编辑，研讨疑误。
李时珍共有4个儿子。长子李建中（考中举人之后又多次参加进士考试，可惜榜上无名。李建中在明穆宗隆庆五年（1571年），出任河南光山县（今同）教谕，挂学官之职，后来迁升为四川蓬溪县（今同）知县。）次子李建元（考取黄州府府学的秀才之后便止步不前。）三子李建方（从父习医，是位通过太医院考选的合格“医士”。四子李建木智力一般，只考了个秀才。）
李时珍此时已有5个孙子，年龄较大的李树宗、李树声、李树勋和李树本四人都各尽所能，帮助他分忧解难。抄写稿件，绘制画图，都付出了大量心血。《本草纲目》不仅是李时珍个人的辉煌业绩，也是他的弟子及李家老少团结协作的结晶。李时珍《本草纲目》完成于明朝万历六年（1578年）。61岁的他年过花甲，他的最大的愿望就是促成《本草纲目》一书流行于世。
李时珍编撰《本草纲目》的目的是要造福人类。为使《本草纲目》早日付梓，为了让广大民众掌握更多的医药知识，他又为该书的出版之事劳神费心。李时珍一辈子靠行医维持生活，自己没有经济实力刻印《本草纲目》，于是鼓足勇气向附近的乡绅提出了这一想法，但都被婉言谢绝。他有些气愤，可转念一想，写书又不是为了他们，没有必要跟他们赌气，本地不行还可以到外地另请高明。他把目标对准了出版业最兴盛的南京城（今同），那里书商多，经营规模大，刻工水平高。如果能在南京找到一家书坊合作，那才是求之不得的好事。李时珍万历七年（1579年），到了南京。
他在南京逗留了挺长时间，找不到对《本草纲目》感兴趣的书商，又借机去了南京附近的几个城市，并于万历八年（1580年）十月到太仓州（今江苏太仓）拜访了以前曾有过几面之交的王世贞。
此时王世贞已卸职在家养老，他热情接待了远道而来的李时珍。两位老人在王家的多山园畅谈了几天，从天文地理到声律农圃，从诗文创作到野鹤闲云，谈得非常投机。李时珍极为赞赏王世贞万历四年（1576年）前后所写的描述太和山美景的诗篇。王世贞也钦佩李时珍的才华及其人品，夸他为“真北斗以南一人”。（《本草纲目·序》）李时珍登门拜访的用意是想求王世贞为《本草纲目》写一篇序文，“愿乞一言，以托不朽”，借助王世贞的崇高声望来宣传《本草纲目》。王世贞接受了李时珍的请求，留下了李时珍带来的数十卷《本草纲目》的书稿。
王世贞万历十八（1590年），相隔10年终于为《本草纲目》写了一篇非常精彩的序，指出这部书“博而不繁，详而有要。综合究竟，直窥渊海”，读了这部书犹如走进“金谷园”和“龙君宫”，令人赞叹不已。他高度评价这部书是“实性理之精微，格物之通典，帝王之秘篆，臣民之重宝也”，从浅层上罗列了一些夸赞之词，并向书商推荐，倡导有识之土刻印、刊行这部医药学巨着。
王世贞的赞誉扩大了《本草纲目》的影响。南京书商胡承龙就在当年，从王世贞那里看到了这部书稿的抄本，认为这部书颇有应用和保存价值，必定受到社会的喜爱，应该流传给后世子孙，同时有利可图，又能捞取一定的名声，所以他决定出资刻印。
胡承龙为《本草纲目》得以付样而感到欣慰。他觉得美中不足的是，在书商的书坊里刻印，成书后发行量有限，最多不能超过500套，而且要价偏高，平民百姓买不起，自然难得一睹。因而李时珍打算把这部书献给朝廷、呈现给神宗皇帝，企盼能够得到最高统治者的青睐，那样就可以在全国范围内广泛流行。
由于身体健康状况不良的原因，已无法梦想成真。从万历二十年（1592年）开始，重病在身却还心系百姓，教诲儿孙们不要忘记村民老少对李家的恩情。
李时珍第二年（159年）的病情继续恶化。恰在这时，南京方面传来喜讯，《本草纲目》的刻印进程已经过半，出书之事已是板子钉钉儿，不会有变。李时珍露出了几分笑容，弥留之际还叮咛儿孙们寻找一切机会将《本草纲目》进献给皇上，争取广泛流传。是年仅76岁的李时珍在初秋的某一天病故。
