1.基因克隆的过程
基因克隆是20世纪70年代发展起来的一项具有革命性的研究技术,可概括为:分、切、连、转、选。“分”是指分离制备合格的待操作的DNA,包括作为运载体的DNA和欲克隆的目的DNA;“切”是指用序列特异的限制性内切酶分割载体DNA,或者分离目的基因;“连”是指用DNA连接酶将目的DNA同载体DNA连接起来,形成重组的DNA分子;“转”是指通过特殊的方法将重组的DNA分子送入宿主细胞中进行复制和扩增;“选”则是从宿主群体中挑选出携带有重组DNA分子的个体。
一般来说,基因克隆技术包括把来自不同生物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接,构建成新的重组DNA,然后送入受体生物中去表达,从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。因此基因克隆技术又有分子克隆、基因的无性繁殖、基因操作、重组DNA技术以及基因工程等多种称呼。
2.基因克隆的常用方法
基因是遗传物质的最基本单位,也是所有生命活动的基础。不论要揭示某个基因的功能,还是要改变某个基因的功能,都必须首先将要研究的基因克隆出来。特定基因的克隆是整个基因工程或分子生物学的起点。下面就基因克隆的几种常用方法进行详细的介绍。
(1)根据已知序列克隆基因
对已知序列的基因克隆是基因克隆方法中最为简便的一种。获取基因序列多从文献中查取,即将别人发现的基因序列直接作为自己克隆的依据。同时,根据蛋白质序列可以将编码该蛋白质的基因扩增出来。在基因文库中注册的蛋白质序列都可以找到相应的DNA或cDNA序列。
(2)根据已知探针克隆基因
这是基因克隆的一种比较常用方法。首先将探针作放射性或非放射性标记,再将其与经过不同内切酶处理的基因组DNA杂交,最后将所识别的片段切下来,克隆到特定的载体(质粒、噬菌体或病毒)中作序列测定或功能分析。这种方法不但可以将基因克隆出来,还能同时观察该基因在基因组中的拷贝数。
(3)未知序列的基因打靶
根据已知序列进行基因克隆,多数是重复别人的工作,或者是在别人工作的基础上继续自己的工作,因而不存在新基因的克隆过程。对未知序列的基因克隆才是真正的创造性研究。