研究重症肌无力实验性动物模型的制备具有重要意义。模型制备方法：以AchR蛋白为免疫原建立动物模型：从丁(氏)双鳍电鳐的电器官分离乙酰胆碱受体(AchR)免疫大鼠,建立实验性重症肌无力(EAMG)动物模型。方法：从丁(氏)双鳍电鳐的电器官提取AchR蛋白,并采用Folin酚试剂法及酶联免疫吸附法(ELISA)检测提取蛋白的含量及活性;以提取的蛋白主动免疫Lewis大鼠,健康、雌性8周龄Lewis大鼠24只随机分为3组,即正常对照组、福(氏)完全佐剂(CFA)对照组、AchR+CFA实验组,每组8只。实验组大鼠分别于足垫、腹部及背部皮下多点注射乳剂15ml,第4周再次注射上述乳剂免疫大鼠。CFA对照组只接受等量CFA皮下注射。用MG患者血清中的AchR抗体建立动物模型：重症肌无力被动转移小鼠模型(P-EAMG)的制作,血清阴性(SNMG)和血清阳性(SPMG)组小鼠每日分别腹腔注射SNMG或SPMG患者血清06ml,连续7d。对照组小鼠注射方法同P-EAMG组。所有小鼠定义词注射血清后24h腹腔注射环磷酰胺(300mg/kg),以抑制小鼠对人血清蛋白的免疫反应。还有用胸腺移植建立重症肌无力动物模型，Schonbeck等将MG患者的胸腺组织移植到严重免疫缺陷小鼠肾被膜下1～2周后,在小鼠血清中可检测到抗人AchRAb，11周时抗人AchRAb滴度增至重度MG水平,且在骨骼肌运动终板处可见Ig沉积。说明MG患者的胸腺组织能诱导和维持自身抗体产生。MG患者切除胸腺后细胞免疫、体液免疫均受抑制,AchRAb减少,纠正了MG免疫调节紊乱,故70%的患者症状缓解或改善。采用乙酰胆碱受体单克隆抗体建立动物模型：采用乙酰胆碱受体(nAchR)单克隆抗体mAb35建立C57BL/6幼年小鼠重症肌无力被动转移模型。健康清洁级,雌性C57BL/6小鼠48只，4～5周龄,体重12～14g，将实验动物分为实验组(E)和对照组(N),实验组分为3组(E1、E2、E3)每组12只。分别经腹腔注射含05、10、15mg/kgmAb35的Ringer’s液02ml给B6幼年小鼠,对照组(N)注射不含mAb35的Ringer’s液02ml。基因疫苗免疫小鼠建立重症肌无力动物模型：用基因疫苗pcDNA2AchRα211免疫C57BL/6小鼠建立实验性自身免疫性重症肌无力模型(EAMG)。方法：将人乙酰胆碱受体α亚基N端的主要免疫区(AChRα211)的基因片段插入到穿梭载体pcDNA30中,构建基因疫苗pcDNA2AChRα211。大量提纯质粒pcDNA2AChRα211后肌肉注射C57BL/6小鼠。用ELISA法检测小鼠血清中抗AChRα211的IgG(AChRAb),并用PCR方法检测外源基因在小鼠各组织器官中的分布情况。此外,用鼠源乙酰胆碱受体α亚基97-116肽段(R97-116)复制EAMG模型；乙酰胆碱受体α亚基125-147肽段可制作实验性重症肌无力动物模型。观察指标：临床观察按Lennon等的分级法将症状严重程度分为4级。0级:没有肯定的无力表现;1级:撕咬无力,四肢力量较差,在光滑地面上前肢打滑,活动减少且易疲劳;2级:明显无力,休息时身体呈隆起姿势,头尾下垂,大腿外展,前肢趾弯曲,动作笨拙,行走不稳;3级:严重无力表现,无撕咬动作,肌肉震颤,呼吸困难,濒死或死亡。AChR数目的计算：将正常小鼠和EAMG小鼠后肢肌肉溶于1%(体积分数)TritonX-100中,分别加入过量125I标记过的α-银环蛇毒(α2Butx)的磷酸盐缓冲液,孵育1～3h后加入过量兔抗鼠IgG进行免疫沉淀反应,所得沉淀物用磷酸盐缓冲液冲洗2遍后用γ-计数仪计数,并用标准曲线求取已结合抗体的AchR数。EAMG模型的AChR数目应较正常鼠明显减少。肌电图：动物麻醉后固定于解剖板上,将成对刺激电极以2～3mm距离插至坐骨切迹附近肌肉内,记录电极置于腓肠肌内侧头(跟腱附着处)。重复用50～100Hz电刺激时EAMG模型的腓肠肌电位及收缩波幅呈衰减反应。光镜观察：实验动物断颈处死,迅速取其腓肠肌,以40g/L多聚甲醛固定,常规制作石蜡切片。然后用011mol/Lα2Butx标记辣根过氧化酶(α2Butx2HRP)孵育切片1h,用PBS洗3次,最后用联苯二胺双氧水(DAB2H2O2)于室温下显色,在光学显微镜下观察运动终板上AChR数目的改变。光镜下可见EAMG动物神经末梢和肌纤维处有巨噬细胞浸润,部分肌细胞呈节段性坏死,运动终板上AchR数目减少。电镜观察：实验小鼠断颈处死,迅速取其腓肠肌,用高碘酸盐-赖氨酸-多聚甲醛(PL P)液固定2h,沿肌纤维走行切成015cm×015cm×11cm大小块,用PBS冲洗,放至01mol/Lα2Butx2HRP中,于4℃孵育2h,用PBS洗净,以DAB2H2O2显色。用立体显微镜观察,选择NMJ多的部位行25g/L戊二醛及锇酸固定,脱水,环氧类树脂(Epon812)包埋,制成6μm切片,经醋酸铀和枸橼酸铅双重染色后,用EM100/CR电镜观察。电镜下显示EAMG动物突触后区域简单化,突触后膜皱褶退化,突触间隙加宽。通过图像分析仪测量神经末梢面积、突触前后膜长度及其比值、突触后膜面积。EAMG动物显示平均突触后膜面积减小,突触后膜长度变短,突触后膜与前膜长度比值变小。影响动物模型成功的因素：动物的品系动物种系的选择：现多采用大鼠和小鼠。其中大鼠对实验性自身免疫性重症肌无力的易感性强弱程度依次递减为W istar>Munich>Fischer>Lewis>Buffalo>Brown>Norway>ACI>Watar Kyoto>Kopen hagen> Wastar Furth；小鼠中单倍型H-2b系对实验性自身免疫性重症肌无力有高度易感性，H-2q系中度易感,单倍型H-2k和H-2p系相对抵抗。其中对实验性自身免疫性重症肌无力的易感性以小鼠C57BL/6、SJL和AKP较高,发病率在50%～70%,其他种系如SWR、BALB/c和C3H/He易感性低,仅为0～15%。动物的年龄：人类大约有60% MG患者是在40岁之后首次出现症状,而小鼠动物模型的成功率却与年龄大小呈相反趋势。年龄大的小鼠可抵抗MG发生,这是由于B淋巴细胞对AchR有记忆作用所致。但是这种记忆反应可被诱导弱化,即在初次抗原致敏后进行再次免疫接种可提高大龄鼠的发病率。因EAMG临床表现、药理学、电生理、免疫学及组织学表现等方面已被证明与MG患者极为相似,是进一步研究人类MG的极佳工具。
245重症肌无力如何进行放射治疗？
可以采用如下方法:采用60COγ线或6mV-X线胸前野垂直照射；1次/d，5次/周，放疗单次量从小量开始，从10CGy/次，甚至50CGy/次逐渐增加至常规分割200CGy/次。放疗总剂量，不伴有胸腺瘤者为2100CGy至2950CGy不等，伴有胸腺瘤者为4000CGy。重症肌无力的发病机理主要是AchR-Ab的作用增强。AchR-Ab主要合成部位为胸腺，临床表现为胸腺异常(胸腺肿瘤或胸腺肥大)。放疗主要是破坏异常增生的胸腺组织，抑制合成AchR-Ab而达到治疗目的。目前传统的方法为药物治疗，但有一部分病人对药物反应差。药物治疗欠佳，有胸腺瘤不能手术的，经放射治疗后症状可明显好转。胸腺放疗的疗效与患者的性别、年龄、病程、病型放疗剂量的大小有关。对于不伴有胸腺瘤者，少于3000CGy临床效果较差。有报告放疗DT4000-5000CGy者可获得较高比率的缓解率，认为应该以5000CGy为宜。伴有胸腺瘤者，放疗剂量要更大些，以4000～6000CGy为宜。不伴胸腺瘤的胸腺放疗剂量可以不需要太高。放疗单次量宜从小量开始，从100CGy/次，甚至50CGy/次，逐渐增加至常规分割200CGy/次，以避免诱发重症肌无力危象。也有人认为Ach-Ab合成部位除了胸腺外，其全身淋巴结等二级淋巴器官也有合成Ach-Ab的B胞和T细胞。脾脏是人体最大淋巴器官，是T、B细密集场所，因此他们主张予全身放疗基础上加脾脏、胸腺、病位局部放疗，据报道可达50%治愈。所以对于药物治疗效果欠佳的重症肌无力者，放疗是一种可尝试的有效方法。
246儿童重症肌无力如何治疗？
