焦磷酸测序技术
最近，新一代DNA序列分析技术——焦磷酸测序技术由于具有分析结果快速、准确、灵敏度高和自动化的特点，也已应用于基因多态性分析。焦磷酸测序技术是由Ronaghi等经多年的研究发展起来的一种新型的DNA测序技术，它通过核苷酸和模板结合后释放的焦磷酸引发酶级联反应，促使荧光素发光并进行检测。作为新一代DNA序列分析技术，对DNA的序列分析不需要平板胶或毛细管电泳，DNA片段也无须荧光标记，不需要荧光激发和检测装置，操作相对简便。该技术主要通过4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团（PPi）。PPi可最终转化为可见光信号，并由PyrogramTM转化为一个峰值。每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比。然后加入下一种dNTP，继续DNA链的合成。但目前只能测定一段较短的目标片段，20～40bp的序列，比DNA自动测序技术短。赵锦荣等应用焦磷酸测序技术，建立耐利福平结核分枝杆菌快速检测方法，在所分析的利福平敏感株中均未检测到rpoB耐药决定区突变，而在耐利福平菌株中均检测到耐药决定区突变，常见突变位点为531和526密码子。Isola等应用焦磷酸测序技术，建立耐EMB结核杆菌快速检测方法，均获得较好的结果。
基因芯片技术
近年来，随着基因芯片技术的快速发展和逐渐成熟，为临床细菌耐药性的快速检测带来了曙光。基因芯片是在固体介质上有序地固定上特定的可寻址的核酸分子而形成的DNA微阵列。是近年来发展起来的集合了分子生物学、材料科学、信息科学、计算机技术等多种学科最新成果的尖端技术，包含了芯片制作、探针制备、杂交洗涤、荧光检测、数据采集处理和信息综合分析等步骤。其基本原理是将多种探针固定于玻璃等载体上，将待测标本的DNA或RNA与探针杂交，即可获得大量信息。大量不同的生物信息分子（如寡核苷酸、DNA或cDNA探针等）以高度密集的方式（通常每平方厘米点阵密度高400），有序地固定在固相支持物（通常为玻璃或尼龙膜等）上而形成微阵列。当荧光标记的靶分子与芯片上的探针分子相结合后，用激光共聚焦荧光扫描或电荷偶联摄像机对荧光信号的强度进行检测，从而对杂交结果进行量化分析，所以可一次性对样品大量序列进行检测和分析。
目前，已有应用Cy3或Cy5标记靶基因rpoB扩增产物，然后用DNA芯片检测PCR产物，结果其检出率为85%左右。利用基因芯片探针杂交方法还可以对两个以上不同的耐药基因同时进行分析，如结核杆菌对INH、RFP、EMB、PZA等多种药物的耐药基因等都可同时进行检测。也可将针对耐药相关的基因的探针和进行菌种鉴定的探针固定到一张芯片上，只需一次杂交，即可获得菌株对药物的敏感性和菌种鉴定的结果。该方法灵敏、方便、特异性高、信息量大，显示了临床应用前景。然而由于该方法目前所需实验材料和试剂成本较高，且需要昂贵检测仪器，因而限制了其在临床实验室的推广应用。
反向系列探针杂交技术
核酸杂交技术根据检测目的和方法的不同，可分为液相杂交、固相杂交及细胞内定位（原位）杂交。固相杂交又可分为斑点杂交、印迹转移杂交。这类杂交技术的特点是将酶切产物或PCR扩增片断直接点膜或经电泳后Southern转移固定至膜上，与液相中标记的特异探针杂交，这种杂交模式称为正向分子杂交。应用该法检测待检样品时，一次反应仅能与一种探针杂交，多用于检测样品中有无所扩增的靶基因。如要对多个耐药基因的多个突变位点同时进行鉴定，则需与多种探针一一杂交反应，繁琐而费时，难以满足临床检测要求。将一系列包括分枝杆菌属、群、种特异的寡核苷酸探针固定于膜或微孔板上，与液相中待检标记的PCR产物杂交的模式被称为反向分子杂交。1989年，Saiki等首次结合PCR扩增并应用反向斑点杂交（reverse dot blot，RDB）方法，即PCR－反向斑点杂交（PCR－RDB）技术同时检测全血中β地中海贫血多种基因突变位点，使β地中海贫血基因突变诊断取得了飞跃式进展。由于PCR-反向斑点杂交技术操作相对简便、快速且价格相对低廉，因而已经在临床检测中应用于基因分型、基因突变检测和病原微生物菌种鉴定等领域。根据探针点样形态和阵列的不同，该技术也可区分为反向系列探针杂交或线条探针杂交（line probe assay，LiPA）技术。
反向系列探针杂交技术原理是：预先将特定的寡核苷酸探针排列固定于固相载体上，采集待检标本，提取基因组DNA或RNA，应用生物素修饰的特异引物扩增DNA或反转录扩增RNA，使PCR产物带有生物素标记，将PCR产物变性后与固定在膜上的特异寡核苷酸探针杂交，通过酶免疫显色法检测和判读杂交结果。Rossau应用Innogenetics 公司开发的检测结核分枝杆菌耐RFP基因型的试剂盒，通过反向杂交试验检测107例已知rpoB序列的结核分枝杆菌分离株4种突变类型和264株通过传统药敏试验检测的临床分离株，检测灵敏度为98%，特异性为100%。
Watterson等[95]则对包括线条探针技术在内的三种分子耐药技术应用于临床分离株、痰标本和支气管灌洗液（BALF）的rpoB基因突变位点检测，结果表明对于临床分离株线条探针技术、错配碱基扩增技术和噬菌体扩增技术的突变检出率分别为100％（16/16）、93.8%（15/16）和100%（16/16）；对于临床痰标本和BALF，线条探针技术、错配碱基扩增技术突变检出率分别为94.7％（36/38）和100%（38/38）。噬菌体扩增技术不能直接对临床标本进行检测。目前，国外已应用该技术开发了检测与RFP耐药相关突变的商品化试剂盒，商标名为INNO-LiPA Rif。该试剂盒以rpoB基因为检测靶序列，设计了5个（S1～S5）探针与结核分枝杆菌野生型rpoB基因广泛杂交，4个用于鉴定下列4种常见突变的R探针：R2，Asp516Val；R4a，His526Tyr；R4b，His526Asp；R5，Ser531Leu及1个结核分枝杆菌复合群鉴别探针。该试剂盒能将检测和鉴定结核分枝杆菌复合群与检测该菌株RFP药物敏感性同时进行。目前的研究表明，与传统药物敏感性检测方法和rpoB测序技术相比较，该试剂盒检测与RFP耐药有关的突变，敏感性为92%～98%，特异性为100%。目前已报道应用的商品化的试剂盒，多限于检测rpoB基因。但能同时检测RFP和INH耐药的试剂盒最近也已有报道。
研究结果显示，反向系列探针杂交技术在临床结核杆菌快速耐药检测中具有极大的应用前景。与目前常规的实验室鉴定方法和其他分子鉴定方法相比，具有明显优势。首先，它可以一次实验同时对多种耐药基因的多种基因位点进行快速基因型别鉴定，具有检测信息量大的特点。其次，它可以直接对临床痰标本进行检测，而目前的噬菌体扩增技术尚不能直接对临床标本进行检测。因此，实验室常规的结核杆菌药敏检测时间可以从目前的4～6周缩短至6个小时，真正可能起到对指导临床医生及早准确用药的作用。另外，同DNA序列测定和最近几年发展的DNA芯片技术相比，反向系列探针杂交技术不需昂贵的仪器设备，所以，更具有在临床实验室应用的潜力。然而，国外已推出的结核杆菌耐药基因检测系统由于价格仍然较昂贵，目前仅限于发达国家临床实验室及研究之用。因此，研制开发适合在发展中国家临床实验室开展使用的新型反向系列探针杂交技术尤为必要。
