二、马媾疫
马媾疫锥虫不能接种于多数实验动物而得到成功的感染，但可将病畜的阴道或尿道刮取物与无菌生理盐水混合，接种于公兔的睾丸实质中，每个睾丸的接种量为0.2m1。如有媾疫锥虫存在，经1～2周后，即可见家兔的阴囊、阴茎、睾丸以及耳、唇周围的皮肤发生水肿，并可在水肿液内检出虫体。
三、胎儿毛滴虫
取病牛阴道分泌物或包皮冲洗液为病料，接种于妊娠天蓝鼠的腹腔内，在接种后1～20d可以使妊娠天蓝鼠发生流产，在其流产胎儿的消化道和胎盘里可查出大量的毛滴虫。
四、弓浆虫
弓浆虫是多宿主病原原虫，多种家畜和实验动物均具有易感性，但小白鼠对其特别敏感，常常仅数十个虫体即可使小白鼠感染发病，故可将病料接种于小白鼠，以对本病进行诊断。一般取急性死亡的可疑动物的肺、淋巴结、脾、肝或脑组织，以1：5的比例加入生理盐水，制成乳剂，并加少量青霉素和链霉素以控制杂菌感染。吸取乳剂0.2ml接种于小白鼠腹腔，一般急性者在4～5d后发病，病鼠被毛粗乱，食欲消失，腹部膨大，有大量腹水，病程4～5d，最后死亡。抽取病鼠或病死鼠的腹水作涂片，染色检查，可见大量游离的滋养体。
第八节寄生虫病的免疫学检验技术
寄生虫作为一种病原体，在其寄生过程中，从生长、发育、繁殖到死亡，必然有分泌、有排泄、有死后虫体的崩解，这些代谢物和虫体崩解的产物在宿主体内都起着抗原的作用，而促使宿主产生相应的抗体，因此可利用抗原抗体间产生的反应（或是用已知抗原去测定机体内抗体的存在，或是用已知的抗体去测定机体内抗原的存在）以诊断寄生虫病。但由于寄生虫体结构的复杂，寄生虫在不同的生活阶段所产生的不同种的蛋白质均起抗原作用，而抗体形成的时间、抗原抗体的作用方式及抗原抗体结合的最适合时间和条件尚未完全弄清楚，所以寄生虫病的免疫过程变得十分复杂。因此以免疫反应作为寄生虫病的诊断手段，就不如以发现病原体（或其某一阶段）来诊断寄生虫病那样可靠。但是当在动物生前无法证实病原体（如体内幼虫的寄生）或寻找病原比较困难的情况下，免疫反应仍然被视为诊断寄生虫病的有效办法。
随着科学的发展，微生物学中所采用的免疫学的诊断方法，均或多或少地被引用到寄生虫病的诊断工作中来，生物化学的发展更给抗原的提纯技术创造了有利条件。而且还有一些是寄生虫病的诊断中所特有的反应。
一、变态反应
变态反应是寄牛虫病诊断中常用的手段之一，其中的皮内反应更是最常用的反应。目前此法的主要问题是抗原（即反应原）的制备主和提纯。
1.抗原的提取在棘球蚴的诊断中，其抗原可直接采用棘球蚴的囊液；在其他寄生虫病，抗原常需经过加工提纯。对某一特种寄生虫病，根据抗原制备的原料不同、抗原性质的不同，各有一定的制备方法：
1.1浸出抗原将病原体洗净，真空干燥或低温干燥，研磨成粉，加生理盐水作100倍稀释，加人防腐剂（0.3％～0.5％的酚）。浸液应不断搅动，可冷浸或热浸，浸制时间随温度而不同，冷浸（在冰箱内）约需3～7d，热浸（56℃）约需2～6h，而后在离心机中离心沉淀，吸取上层清液，用间歇法灭菌。滤出液即可作为抗原。
1.2三氯醋酸提纯抗原适用于棘球蚴抗原的提纯。取棘球蚴囊液，加入5％的三氯醋酸使其蛋白沉淀，以离心法收集沉淀；再用蒸馏水反复冲洗沉淀，最后将沉淀物混悬于蒸馏水中，慢慢滴加10％NaOH溶液，直到其中沉淀全部溶解为止。溶液在低温下加0.1N冰醋酸重新使蛋白质沉淀，再以离心法收集沉淀，以蒸馏水洗去酸，在37℃温箱中或氯化钙干燥器中干燥，所得干粉，即供配制抗原用。
1.3酸溶性蛋白质抗原将蠕虫的成虫或幼虫研制成干粉，用滤纸包起，置Soxhlet回流器中以石油醚脱脂，经4～5d后，得脱脂的虫体干粉。将干粉浸于pH8.0～8.3的硼酸缓冲液中，搅拌5～10min，置于4℃冰箱中6h，以离心法除去沉淀，再加入pH4.6的溶液于上清液，再离心沉淀，其上清液即酸溶性蛋白抗原。
1.4多糖抗原将虫干粉浸于pH8.0～8.3的硼酸缓冲液中，置沸水浴上半小时，边煮边搅，而后取下冷却，置4℃冰箱中4h取出，离心除去沉淀；取上清液加4倍量的95％酒精，再加适量氯化钠使成为0.5％的盐水溶液，再放人4℃冰箱中4h，取出，离心沉淀，所得白色沉淀加入pH8.0～8.3的硼酸缓冲液使溶解，再离心沉淀，除去不溶物，再在上清液中加入95％酒精以沉淀其多糖体，离心，取得白色沉淀，真空干燥后即得多糖抗原。
2.可用皮内反应作诊断的寄生虫病有一些寄生虫病可用皮内反应作为诊断方法，但目前被广泛应用的为数不多，曾试用的疾病有弓浆虫病、锥虫病、片形吸虫病、棘球蚴病、多头蚴病、猪囊虫病、冠尾线虫病、马脑脊髓丝虫病、蛔虫病、牛皮蝇蚴病等。现介绍两种常用的皮内变态反应：
2.1弓浆虫病的皮内反应先取人工感染弓浆虫的小白鼠，收集其含有弓浆虫的腹水，用离心法将虫体浓集，加蒸馏水，以反复冻融或超声波将虫体崩解破坏，而后冻干制成皮内反应抗原。有人建议再将抗原用丙酮醚抽提以提纯。
将稀释的抗原0.2ml注射于猪的耳根部皮内，以观察其皮肤反应。反应在48h后出现，当红肿面直径超过15mm时为阳性，10～15mm为可疑，9mm以下为阴性。
弓浆虫的皮内反应阳性，只在猪患本病的晚期才呈现，因此本法只适用于流行病学的调查，以检出慢性的的隐性的弓浆虫病。
2.2棘球蚴病的皮内反应这是1911年由Casoni氏首创，最早用皮内反应诊断寄生虫病的方法，因此又称Casoni氏反应。最初以无菌手术抽取棘球蚴囊液作为反应原。囊液在使用前最好进行一次无菌试验；如囊液混浊，应先离心沉淀或过滤，以达到完全透明。此囊液可加入0.5％氯仿防腐，以利于保存，保存期达6个月。Dennis提出三氯醋酸提纯法。Orihara （1967年）认为：将皮内反应抗原经100℃15min处理，可破坏抗原中的宿主成分，因虫体抗原对热是稳定的，这样可增加抗原的特异性和灵敏性。
操作时是将抗原0.1～0.2ml，以皮内注射针头注射于无毛处（或先剃毛）的皮内。阳性反应时，在注射后5～l0min内（最迟不超过0.5～lh）注射部出现红肿，红肿面积直径可达5～20mm。以后红肿部周围发生红色圆晕而后变紫红色。
二、沉淀反应
感染寄生虫后，动物血清中即含有特异性抗体，此抗体与病原体的抗原相结合，可产生沉淀。用此法测定动物体内抗体的存在与否，以决定动物是否感染有某种寄生虫。
1.活体沉淀反应一般取寄生虫生活的各幼虫阶段或虫卵，放于被检者的血清内，如在幼虫或虫卵周围或某一部位形成沉淀，则表示被检者血清内已含有抗体，即说明被检者已受该寄生虫的感染。根据这一原理所研制的方法有：血吸虫病的环卵反应、尾蚴膜反应和蛔虫幼虫的沉淀反应等，虽在兽医临床上尚未实际应用，但已取得了很多的经验。
1.1分体吸虫病的环卵试验：其方法是取人工感染日本分体吸虫的兔肝，捣碎后，经分层过滤、离心沉淀或以胰酶消化肝组织，而后将所得虫卵悬液加福尔马林醛化，减压低温干燥制成干卵备用。
试验时，在载玻片上滴加被检牛血清1滴，挑取干卵1小团（约100个虫卵）混于血清中，覆以盖玻片，四周用石蜡封固，放入37℃温箱中，24h后取出检查。阳性者，则于虫卵四周出现泡状、索状、耳状、网状等血清学反应的沉淀物质。判定时，根据反应卵的百分比，反应物的面积和形状为指征。
1.2蛔虫幼虫沉淀反应：为了对蛔虫幼虫移行期所致的蛔虫性肺炎进行诊断，可使用幼虫沉淀反应。其方法是：用人工感染蛔虫的小白鼠，6d后自肺内分离幼虫；经生理盐水洗净后，放人数滴被检血清中，置37％温箱中24h后，如在蛔虫幼虫的口部和肛门等处出现沉淀，则判断为阳性。
2.琼脂扩散沉淀反应在诊断上采用的琼脂扩散沉淀反应有单相单扩散、单相双扩散、双相单扩散和双相双扩散；还有借电流力量促使其沉淀发生的对流免疫电泳法。在此主要介绍马锥虫病诊断上所采用的双相双扩散的沉淀反应，即马媾疫琼脂扩散沉淀反应。
2.1沉淀原的制备：自病马采取病料，接种于公兔的睾丸实质中，继代数次；当在兔外剧血液出现虫体时，采血接种到犬。在人工感染犬后的第3d，给犬进行摘脾手术，术后检查犬血，当以其外周血作压滴检查，600倍镜下，每个视野虫体量达到150条以上时，即可放血，加2％柠檬酸钠生理盐水以抗凝，离心沉淀；沉淀后吸取上层白色含虫层，混悬于生理盐水中，再沉淀；如此反复多次，得到较纯的虫体沉淀物。将沉淀物放乳钵中研磨4小时，放入振荡瓶中，加小玻璃珠，在振荡器上振荡8h。按1：9比例加生理盐水。最后按其量加入万分之一的硫柳汞防腐，保存于冰箱中，即为沉淀原。
2.2琼脂凝胶板的制备：在蒸馏水中加入5％琼脂，高压蒸气下使其溶解；冷凝后，切取上层透明部分，切成碎块，在蒸馏水中漂洗2～3d，每天换水2～3次，最后将水拧干，保存于冰箱内。
做琼脂凝胶板时，取以上凝胶块150g，加水500ml，溶解，使其含琼脂1.5％，再加入氯化钠，使含量达0.85％，和硫柳汞，使其含万分之一，高压灭菌后，倒人平皿内，使琼脂厚度约为5mm左右。
琼脂凝固后，在琼脂板上以直径8mm的打孔器打孔。一般在皿的正中打一孔，而后以4mm的距离在中央孔的周围打6个孔，使其成梅花状分布，再用熔化的琼脂，向每孔中滴1—2滴，将孔底封闭。
2.3操作方法：将皿上各孔编号；以吸管吸取抗原0.2ml，注于中央孔内；然后向周围四孔加入待检血清0.2ml，留下两孔，一孔加已知阳性血清，一孔加已知阴性血清为对照。如此，每一平皿可检查可疑病畜4头。将琼脂板放人25℃～28℃温箱内，24h后取出检查，阳性者可在血清孔与抗原孔之间的琼脂上出现一条白色沉淀。
三、凝集反应
凝集反应所用抗原有活的虫体抗原（多半用于微小的原生动物）和液状抗原。以液状抗原进行本试验时，多半将其吸附于惰性颗粒上，再进行间接凝集试验。用以吸附抗原作为载体的颗粒有：红细胞、卡红（carmine）、炭粉、皂土（bentonite）和乳胶（1atex）等。
1.活抗原凝集反应马、牛伊氏锥虫病的团集反应（agglomeration）即属此反应。操作时，自感染有锥虫的实验动物采血，在血液中见有大量虫体时，将所采血以改良阿氏液稀释（阿氏液是以葡萄糖2.05g，柠檬酸钠0.8g，柠檬酸0.055g，氯化钠0.42g，蒸馏水l00ml配成）。以在显微镜下450-600倍放大时，每个视野中含虫体30-50个，并见虫体运动活泼，无自然团集现象为准。此时将被检血清l滴加在载玻片上，将上述活虫1滴加入，混匀，置37℃温箱中，20～30min后取出镜检。虫体在阳性血清中以后端相互靠拢，成菊花状排列，但虫体仍保持活动。
活抗原凝集反应，国外尚介绍用于牛胎毛滴虫病，并报道胎毛滴虫的凝集素除见于血清中外，尚出现于感染母牛的阴道粘液中，故可见虫体在含有阴道粘液的琼脂平板上出现凝集现象，而以此为指标作阴道毛滴虫病的诊断。活抗原凝集反应亦曾用于弓浆虫的诊断。
